chapitre 4 méthodes

vecteurs viraux, enzymes virales … reverse transcriptase, ANR polymérases…

Escherichia coli Clonages d’ADN, amplification de plasmides Production de protéines recombinantes

Saccharomyces cerevisiae (levure) Production de protéines recombinantes Approches génétiques

le fait d’introduire un ou plusieurs gènes dans un organisme afin que ce ou ces derniers y soient exprimés

La transgénèse classique se réalise en injectant de l’ADN linéaire dans un ovocyte fécondé afin qu’il soit incorporé aléatoirement dans le génome murin.

La recombinaison homologue est à l’origine un mécanisme mis en place par la cellule lors ou de la méiose ou en cas d’erreur dans la réplication de l’ADN. La cellule reconnaît des portions de son ADN identiques à celui du transgène et échange ce dernier avec son gène. Cela conduit à l’insertion du transgène à l’endroit même où les portions identiques étaient présentes. Ainsi, les biologistes peuvent introduire leur transgène où ils le souhaitent dans le génome en choisissant quelle portion identique à celui-ci ils insèrent à leur transgène.

Il s’agit de l’inactivation d’un gène en générant des codons STOP précoces qui inactivent la protéine et conduisent à sa dégradation par la cellule en effet, si l’on ne propose pas à la cellule d’ADN de remplacement après avoir sectionné une séquence, cette dernière tentera de réparer l’ADN sans recombinaison homologue, ce qui crée un décalage du cadre de lecture et donc des codons stop prématurés (cf. cours d’UE2 sur la traduction). La meilleure façon d’identifier le rôle d’un gène cible est de l’inactiver.

Il s’agit du remplacement d’un gène par le transgène (qui peut être un gène rapporteur, une modification du gène initial ou autre).

signifie “Clustured Regularly Interspaced“ Short Palindromic Repeats’. Il s’agit de répétitions palindromiques situées dans le génome des bactéries. Elles sont identiques à des séquences d’ADN viral et ont été introduites pour servir de défense contre ces dernières.

du grec pálin « en arrière » et drómos « course ». Désigne un texte ou un mot dont l’ordre des lettres reste le même qu’on le lise de gauche à droite ou de droite à gauche, comme dans la phrase « Ésope reste ici et se repose » ou encore « Elu par cette crapule ».

portion nucléotidique exogène qui permet d’exprimer un gène dans une cellule hôte. Il peut s’agir de plasmides, mais aussi d’autres choses comme des virus.

Lipofection Micro-injection Electroporation Bombardement avec des particules (or ou tungstène)

Faux, l’ADN est plus stable et permet de synthétiser plus de protéines

une méthode qui permet de séparer tous les constituants cellulaires selon leur taille et leur forme en réalisant plusieurs cycles de centrifugation à accélération croissante.

une technique très utilisée par les chercheurs en biologie cellulaire lorsqu’ils travaillent sur des protéines (on en trouve beaucoup dans l’épreuve du concours aussi). Il s’agit d’un SDS-PAGE électrotransféré sur une membrane où seules les protéines souhaitées sont révélées de manière spécifique grâce aux anticorps (sa méthode de détection par les anticorps est décrite dans la partie Amplification d’un signal de révélation par anticorps). Néanmoins, les autres protéines sont toujours présentes mais ne sont pas révélées. Il permet donc d’apprécier la présence ou non d’une protéine dans un extrait cellulaire et de comparer sa quantité relative avec d’autres situations.

Cette méthode permet de détecter et doser un anticorps.

Le test ELISA en sandwich permet, comme l’ELISA par immunocapture, de détecter et doser un antigène. Son utilité est qu’il permet de révéler de très faibles quantités d’antigène, qui n’auraient pas pu l’être avec l’ELISA par immunocapture habituel.

consiste à séparer certaines protéines des autres par le même principe que la chromatographie d’affinité mais ce sont des anticorps qui sont fixés aux billes.

démontrer une interaction entre les protéines d’un même complexe.

(« Polymerase Chain Reaction ») est une technique permettant l’amplification in vitro d’une région d’ADN bien spécifique. Comme son nom l’indique, elle utilise une Polymérase qui synthétise en grand nombre la région d’ADN prédéfinie.

▪ Diagnostic de pathologies dues à des génomes exogènes (bactériologie, virologie, parasitologie) ; ▪ Diagnosticrapidedesinfectionspourlesquellesilfallait,ilyaquelquesannées,plusieurs semaines de culture (par exemple pour le bacille de la tuberculose ou le SARS-CoV-2) ; ▪ Détectiondirectedansdesmilieuxcomplexes,sansisolementpréalabledugerme; ▪ Médecine légale, cancérologie, diagnostic prénatal voire préimplantatoire à la fécondation in vitro.

200 nm

consiste à marquer par fluorescence des sondes d’acides nucléiques pour qu’elles aillent révéler une cible spécifique directement dans la cellule.

1nm