3.1- Polymérases et PCR

processus permettant de multiplier un fragment d’ADN choisi permet de recopier in vitro un très grand nombre de fois en utilisant des ADNpol thermostables

enzyme de polymérase

catalyse la synthèse d’ADN à partir d’une amorce liée sur sa matrice

Un bout OH3’ libre sur une amorce et des ions Mg

Pfx, Pfu, Vent

Pfu, Pfx

non. donc il ne peut pas couper les liaisons phosphodiesters des OH aux extrémités, donc ne peut pas corriger ses erreurs de réplication

évalué par le taux d’erreurs ADNpol dépourvus d’Activité exonucléase 3’ - 5’ ont un taux d’Erreur plus élevé

4 nucléotides (A,T,C,G) ADNpol pour catalyser la réaction Amorces d’ADN de séquences connues (18-20nt) qui vont s’hybrider aux régions monocaténaires de façon très spécifique et présenter une extrémité 3’-OH libre pour le recrutement de la pol

1- dénaturation: dénaturation à 95°C qui provoque la séparation des deux brins de tous les fragments d’ADNdb 2- amorçage: processus d’hybridation à 55°C qui permet aux amorces de s’associer par complémentarité aux régions du fragment d’ADN que l’on veut amplifier 3-polymérisation: à 72°C la réplication du fragment d’ADN à partir des amorces avec l’intervention de l’ADNpol

fragment amplifié par PCR

Mg2+ cofacteur essentiel à la polymérase interagit avec les charges négatives de la chaîne d’ADN, limitant les forces de répulsion entre brins d’ADN et favorise la stabilité de l’hybridation Plus sa concentration est importante, plus l’hybridation est facilitée (spécifique ou non). Une concentration trop forte peut mener à une augmentation de signaux aspécifiques

sert à tamponner le milieu réactionnel au niveau optimal pour l’activité de la Taq polymérase

1- placer au Tm du couple d’amorces, si le Tm est différent pour les 2, utiliser le plus bas comme référence 2-choisir une température d’hybridation de 54°C comme point de départ, si amplifications non-spécifiques, augmenter par paliers de 2°C Tm= 4°C(no G et C) + 2°C(no T et A)

-50% de GC et AT -soit un G ou un C en 3’ -un Tm rapproché

-accessibilité de la région d’amorçage -amorçage non-spécifique -formation de structures entre amorces (épingle à cheveux, homodimères, hétérodimères)

-séparation des molécules d’ADN selon leur tailles -à pH neutre, ADN à une charge fortement négative, donc se déplacent vers l’électrode positive quand le gel contenant les échantillons est submergé dans un tampon et soumis à un courant électrique

pour visualiser les bandes d’ADN séparées sur un gel, incube dans une solution de BrEt Le BrEt fixe et s’intercale entre les paires de bases quand le gel est illuminé par des rayons UV, les régions contenant de l’ADN émettent une fluorescence plus marquée que les régions dépourvus d’ADN

-amplification de la région amplifiée -2 paires d’amorces sont utilisées: une première réaction utilise une paire dont la spécificité permet d’amplifier un petit nombre de séquences homologues une deuxième réaction avec amorces internes aux premiers amplicons pour sur-amplifier la région d’intérêt -amorces externes= 10 cycles amorces internes= 25 cycles -procédure pour la détection de régions de faibles concentrations